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概述

嵌合抗原受體（CAR）是經(jīng)過(guò)改造后賦予T細(xì)胞靶向特定抗原的新能力的受體蛋白。這些受體是嵌合的，因?yàn)樗鼈儗⒖乖Y(jié)合和T細(xì)胞激活功能結(jié)合到一個(gè)受體中。CAR-T細(xì)胞療法使用經(jīng)過(guò)CAR改造的T細(xì)胞來(lái)治療癌癥。CAR-T免疫療法的前提是修改T細(xì)胞識(shí)別癌細(xì)胞，以便更有效地靶向和消滅它們?？茖W(xué)家從人體中獲取T細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行基因改造，然后將產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞注入患者體內(nèi)以攻擊他們的腫瘤。

使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀監(jiān)控CAR-T細(xì)胞療法的生產(chǎn)

自2018年獲得FDA批準(zhǔn)以來(lái)，CAR-T療法已使血液惡性腫瘤患者的緩解率達(dá)到80%。與所有過(guò)繼細(xì)胞療法一樣，自體或同種異體CAR-T療法的生產(chǎn)是一個(gè)復(fù)雜的生物制造過(guò)程，需要嚴(yán)格遵守監(jiān)管和QA/QC指南。為了確保最終產(chǎn)品的安全性、質(zhì)量和功效，必須在整個(gè)開(kāi)發(fā)和生物加工流程的過(guò)程中評(píng)估和監(jiān)控細(xì)胞的健康和活力。在此，我們演示了如何使用LUNA-FX7細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來(lái)監(jiān)測(cè)和評(píng)估CAR-T過(guò)程中關(guān)鍵階段的細(xì)胞健康狀況：

（1）收集主要來(lái)源材料

（2）白細(xì)胞分離后

（3）分離/激活

（4）擴(kuò)增

（5）生產(chǎn)

使用核酸染色劑吖啶橙和碘化丙啶（AO/PI）在熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)模式下使用LUNA-FX7進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。簡(jiǎn)而言之，對(duì)于每次計(jì)數(shù)，將2 μl預(yù)混合AO/PI溶液與18μl細(xì)胞混合，裝入2、3或8通道載玻片中，并利用自動(dòng)對(duì)焦功能進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于最終劑量測(cè)定，使用分析體積為5.1 μl（大多數(shù)自動(dòng)化體積的10倍）的LUNA 1通道載玻片。

1、全血樣本的初始白細(xì)胞濃度和活力

在采血完成后和進(jìn)行白細(xì)胞分離前，用1x PBS按1：100稀釋細(xì)胞，以便在LUNA-FX7中計(jì)數(shù)。盡管白細(xì)胞(WBC)僅占全血的2%，但如圖展示了如何輕松區(qū)分異質(zhì)群體中的有核細(xì)胞和無(wú)核細(xì)胞（紅細(xì)胞）。

明場(chǎng)(BF)、綠色通道(GF)和紅色通道(RF)的平鋪圖像(A)。標(biāo)記的(活/死有核細(xì)胞)圖像的疊加圖像(B、C)。1/100稀釋血液的白細(xì)胞總數(shù)和活力(D)

熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)模式下CAR-T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方案參數(shù)設(shè)置

2、白細(xì)胞的分離

白細(xì)胞去除術(shù)是從全血中分離白細(xì)胞的過(guò)程。下圖顯示了2個(gè)不同樣品的活力。兩個(gè)樣本中均未發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞，但仍可觀察到一些細(xì)胞碎片。同樣，LUNA-FX7可以輕松區(qū)分細(xì)胞和細(xì)胞碎片，限度地減少誤報(bào)計(jì)數(shù)的可能性。

白細(xì)胞分離后的細(xì)胞濃度和活力。白細(xì)胞分離后的WBC樣本計(jì)數(shù)以及BF、GF和RF原始圖像(A)、FL標(biāo)記圖像和放大圖像(B、C)。評(píng)估兩個(gè)樣品并繪制細(xì)胞濃度和活力圖（D，E）

3、T細(xì)胞的分離和激活

白細(xì)胞分離后，T細(xì)胞被進(jìn)一步分離并激活，產(chǎn)生同質(zhì)T細(xì)胞群。此階段，樣本質(zhì)量存在明顯對(duì)比。

分離和激活后對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以及BF、GF和RF原始圖像(A)、FL標(biāo)記圖像和放大圖像(B、C)。假陽(yáng)性碎片可以通過(guò)最小細(xì)胞大小設(shè)置(D)來(lái)消除。評(píng)估兩個(gè)樣品并繪制細(xì)胞濃度和活力圖（E、F）

4、CAR表達(dá)的T細(xì)胞

分離并激活的 T 細(xì)胞通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生嵌合抗原受體 (CAR)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，新設(shè)計(jì)的CAR-T細(xì)胞再離體擴(kuò)增。下圖顯示了細(xì)胞活力和擴(kuò)增的CAR-T細(xì)胞數(shù)量。

CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增后的細(xì)胞濃度和活力。CAR-T細(xì)胞樣本的原始圖像和標(biāo)記圖像（A、B、C）以及細(xì)胞濃度和活力（D、E）

5、CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品

擴(kuò)增的CAR-T細(xì)胞被冷凍保存并評(píng)估劑量。如圖顯示具有不同細(xì)胞活力的2個(gè)樣品的活力和濃度。

結(jié)論

從最初收集主要原材料到最終劑量確定，LUNA-FX7™滿足在整個(gè)CAR-T生產(chǎn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)細(xì)胞健康和活力的需求。此外，結(jié)合預(yù)設(shè)的驗(yàn)證載玻片、內(nèi)部QC軟件和可選的21 CFR Part 11合規(guī)軟件，可確保滿足和維持嚴(yán)格的QC和監(jiān)管指南。

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