實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　麻醉劑：(應(yīng)較好的控制大鼠體溫)

　　保溫：60W白炙燈高度為37cm直接照射能使肛溫保持在 37℃

　　栓線(xiàn)的制備：1.取熔點(diǎn)為56℃的固體石蠟一塊，在瓷杯中加熱熔化。直徑為o.24mm、長(zhǎng)5cm的魚(yú)線(xiàn)一端5mm長(zhǎng)的一段，垂直在熔化的石蠟中迅速浸入并提起，立即凝固的一薄層石蠟可牢固地粘附在魚(yú)線(xiàn)一端的表面，其直徑為0.26mm。就這樣，普通的魚(yú)線(xiàn)即可變成規(guī)相一致頭端光滑圓鈍的栓線(xiàn)。

　　2.在魚(yú)線(xiàn)18mm的位置用涂改液標(biāo)記一個(gè)白色點(diǎn)。

　　TTC的配制：用0.2mol/L磷酸緩沖液(PBS)配成2%TTC溶液(pH7.5),避光保存。

　　體重與栓線(xiàn)直徑： 線(xiàn)栓直徑0.24mm采用的SD大鼠，體重250-300g。

　　實(shí)驗(yàn)方法：

　　動(dòng)物用10%(35mg/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線(xiàn)切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，在CCA遠(yuǎn)心端和近心端及ECA處掛線(xiàn)備用。用微暫時(shí)夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4mm處剪一小口，將拴線(xiàn)插入到ICA，這時(shí)用繞在CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線(xiàn)輕輕系牢拴線(xiàn)。(不可過(guò)緊，否則近線(xiàn)困難，但松了又會(huì)出血。)用輕推拴線(xiàn)，從血管分叉處開(kāi)始算距離，當(dāng)插入深度在18 mm時(shí)(一定要將血管放松至原來(lái)狀態(tài), 且保證標(biāo)記點(diǎn)在分叉處,由于標(biāo)記的是白色的所以很容易看的)，緊緊系牢CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線(xiàn)，此時(shí)的關(guān)鍵是動(dòng)作輕柔，不要使ICA有任何的牽拉，否則栓線(xiàn)會(huì)脫出ACA，可能會(huì)造成缺血失敗。血管外的栓線(xiàn)不要留得過(guò)長(zhǎng)，更不要縫在皮外，大鼠醒來(lái)后會(huì)自己拔出。縫合傷口，單籠飼養(yǎng)觀(guān)察。如果需要再灌的話(huà)，就把拴線(xiàn)抽出即可，因?yàn)槟X底有個(gè)動(dòng)脈環(huán)，結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈大腦不會(huì)缺血的。

　　注意事項(xiàng)：

　　1.分離時(shí)要層次清楚：正中剪開(kāi)SD大鼠頸部皮膚，分離皮下結(jié)締組織時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)該組織與頸部?jī)蓚?cè)鼓泡腺體(很多人誤認(rèn)為那是甲狀腺)結(jié)合緊密，因此不必分離過(guò)于太細(xì)，直接在正中兩側(cè)鼓泡腺體之間分離，這樣能不接觸胸鎖乳突肌而直接暴露頸前頸群且不會(huì)損傷腺體造成過(guò)多出血。下一步是分開(kāi)頸前肌群，這時(shí)候要注意用小鉗子作撐開(kāi)分離動(dòng)作要在左右肌肉塊之間而不是一塊肌肉的肌纖維之間，雖然它們看起來(lái)很模糊，但這樣能保證不會(huì)出現(xiàn)較多條索狀細(xì)肌纖維條影響下一步頸內(nèi)動(dòng)脈的尋找與分離，并且能整塊地向一側(cè)牽開(kāi)頸前肌群暴露頸。見(jiàn)到頸了則要注意細(xì)致分離迷走神經(jīng)，若損傷則可能影響其呼吸而死亡的。

　　2.分離血管時(shí)，要盡量將血管剝離的干凈些，這樣在用眼科剪剪口時(shí)就不會(huì)誤剪外膜(誤剪的話(huà)再剪就很容易把口剪大了或者剪斷了，要注意口子越小越好插線(xiàn))，且要剪一個(gè)斜行的切口(眼科剪與血管約成45度)，這樣在血液剛流出時(shí)仍能看上翻的斷口管壁，這樣即容易插入栓線(xiàn)且血管受得了插線(xiàn)時(shí)一定的牽拉。當(dāng)然，切勿牽拉過(guò)猛，以免使血管發(fā)生痙攣，導(dǎo)致栓線(xiàn)不能順利進(jìn)入。

　　3.注意盡量不要損傷在頸內(nèi)頸外分叉下的交感神經(jīng)節(jié)。

　　4. 如果你用的是中長(zhǎng)效麻醉劑，插線(xiàn)成功后，固定絲線(xiàn)，然后讓其俯臥位，而且稍稍抬高其頸部，才能確保模型成功。

　　5. 栓線(xiàn)進(jìn)入后頸內(nèi)動(dòng)脈后即可逐漸插入了，有時(shí)候很順利一插到底，但有時(shí)候在中間就怎么也進(jìn)不去了，這是因?yàn)樵谘苋腼B穿過(guò)顱骨時(shí)有一個(gè)狹窄或者角度。因此，碰上這種明顯阻力時(shí)，一定不能盲目向前使力插，越插栓線(xiàn)前端變形越進(jìn)不去且容易損傷血管。這時(shí)候正確的作法是往外抽出較多栓線(xiàn)，也許會(huì)有一定的動(dòng)脈血流出，不必慌，只要順著血管走行調(diào)整一下進(jìn)線(xiàn)角度輕柔的使勁，一般都能進(jìn)去，反復(fù)試幾次還不行換根栓線(xiàn)，很可能前端也經(jīng)變形角度變了!頸內(nèi)動(dòng)脈的走向?yàn)閮?nèi)上方,可以用夾住魚(yú)線(xiàn)插,但進(jìn)去后要注意,別太用力,要不血管就要破了

　　6. 栓線(xiàn)不能在血管里反復(fù)進(jìn)退，否則及容易造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，，而且很容易誤解為模型成功，因?yàn)檫@時(shí)的神經(jīng)功能改變也很明顯，但并不是由于栓塞引起的

　　7. 進(jìn)線(xiàn)時(shí)，使栓線(xiàn)有一定程度的彎曲，且只要保證栓線(xiàn)向屋頂方向彎曲，一般都能將線(xiàn)插如顱內(nèi)，決不會(huì)進(jìn)入翼腭A。

　　8. 術(shù)后一定要注意保暖。

　　9. 插入線(xiàn)拴要輕柔熟練，速度盡可能快，以避免時(shí)間長(zhǎng)了血管內(nèi)血栓形成。

　　10.手術(shù)后評(píng)分的主觀(guān)因素很大，有用5分制和11分制的，我個(gè)人認(rèn)為用5分制比較準(zhǔn)些。

　　舍去標(biāo)準(zhǔn)：

　?、潘ň€(xiàn)插入深度不足18 mm,且無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)或癥狀很輕的大鼠

　?、?蛛網(wǎng)膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis環(huán)動(dòng)脈有凝的大鼠，因?yàn)檫@是出血性腦損傷或性腦缺血損傷，而非MCAO/Reperfusion損傷。

　　3)手術(shù)時(shí)出血較多，癥狀很重的動(dòng)物。

　　死亡原因分析：

　　首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的腦，先看是否有蛛網(wǎng)膜下腔出血，如有出血，表明死因是插線(xiàn)太深，以后注意插線(xiàn)深度;如無(wú)出血，則還要再看是否有嚴(yán)重的半球水腫，如水腫嚴(yán)重，則表明死因是腦缺血時(shí)間太重，需要縮短缺血時(shí)間;如既無(wú)出血，又無(wú)明顯的腦水腫，那就要注意動(dòng)物狀態(tài)或生活環(huán)境是否太差。

　　附帶的其他說(shuō)明：

　　1..線(xiàn)拴法存在一定的死亡率。對(duì)于這情況我感覺(jué)比較頭疼，也希望高手指點(diǎn)。

　　2. 模型成功率和評(píng)價(jià)指標(biāo)是相關(guān)聯(lián)的矛盾，手術(shù)后可根據(jù)動(dòng)物的表現(xiàn)加以評(píng)分，確定模型是否成功，模型成功與否會(huì)對(duì)結(jié)果的評(píng)價(jià)帶來(lái)影響。有可能你模型沒(méi)成功，結(jié)果判斷為是藥物的作用效果。所以對(duì)手術(shù)后模型是否成功應(yīng)該進(jìn)行篩選的。另一方面，如果你做了預(yù)防給藥，藥效的作用也容易被認(rèn)為是模型不成功，這也需要后邊進(jìn)行腦組織染色和組織血檢查進(jìn)行驗(yàn)證。腦組織檢查時(shí)可剔除模型不成功以及SAH的個(gè)例。

　　故實(shí)驗(yàn)在手術(shù)后要進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)應(yīng)對(duì)腦組織進(jìn)行組織學(xué)檢查或染色。TTC染色是采用的宏觀(guān)標(biāo)本染色，確定梗死面積可采用體積法或面積法，但用掃描儀將腦組織切片進(jìn)行掃描，選擇合適的軟件統(tǒng)計(jì)梗死面積。

　　3.大鼠大腦中動(dòng)脈性閉塞性腦缺血模型，梗死體積出現(xiàn)的最小時(shí)間點(diǎn)可能為2h，體積隨時(shí)間進(jìn)行性增大，至12h基本趨于穩(wěn)定

　　4. 整個(gè)試驗(yàn)是很費(fèi)動(dòng)物的，存在15-30%的淘汰率(如果你做的好)，但注意嚴(yán)格控制自己淘汰的動(dòng)物(紀(jì)錄具體情況)。

　　5. 除了剛才說(shuō)的蛛網(wǎng)膜下腔出血外，還有一些老鼠肺出血明顯，整個(gè)肺暗紅，我也想不出原因，不知道是不是醫(yī)學(xué)臨床所說(shuō)的腦肺綜合癥.

　　6.在頸內(nèi)和頸外之間常常會(huì)有一個(gè)交通支，其位置也不太相同，一定要萬(wàn)分小心，我曾經(jīng)因?yàn)椴恢羞@個(gè)交通支而勿將其破壞，導(dǎo)致大鼠出血不止!