疼痛是一種復雜的生理心理活動，常涉及中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)末梢受到刺激超過其閾值后，會向中樞發(fā)送電信號，大腦接收到這種信息產(chǎn)生疼痛感。異常性疼痛和痛覺過敏是神經(jīng)性疼痛的兩項突出癥狀，對其充分解讀有助于提供神經(jīng)性疼痛潛在病理生理機制的相關(guān)線索和提供更好的治療方案。

神經(jīng)性疼痛發(fā)病機制

異常性疼痛與痛覺過敏是依據(jù)不同刺激誘發(fā)的感覺形式而分類，誘發(fā)形式主要有觸、壓、冷、熱。嚙齒類動物作為的實驗室動物被廣泛應(yīng)用于疼痛研究領(lǐng)域，對嚙齒類動物觸覺異常性疼痛和疼痛過敏測式工具主要為：Von Frey纖維絲、e-VF電子測痛儀、動態(tài)足底測試儀（DPA）。

觸痛測試的傳統(tǒng)工具：Von Frey纖維絲

一. Von Frey纖維絲的起源

早期Von Frey測試絲

二. Von Frey纖維絲的發(fā)展

現(xiàn)代Von Frey纖維絲

三. Von Frey纖維絲統(tǒng)計模型的建立

1980年Dixon和Mood確定Von Frey纖維絲測試Up-Down上下法閾值計算模型。除此之外還有極限法、中位閾值法、頻率法。但Up-Down上下法確定半數(shù)陽性反應(yīng)常用。閾值與測試絲的對數(shù)呈很好線性關(guān)系：

50%縮足閾值（g）=（10[Xf+kδ]）/10000，Xf = log10(10F)

其中 Xf 為根測試絲編號；δ為各根測試絲取對數(shù)后的均差；F為測試絲毫克數(shù)；k為根據(jù)測量獲得的“X”、“O”序列查表后獲得的系數(shù)值。

四.Von Frey纖維絲存在的缺陷

1.反復測量耗時巨長
操作測試過程要求騎跨現(xiàn)象存在，當動物出現(xiàn)“OX”或“XO”的騎跨時，再連續(xù)往后測量四次。這就要求得到一次測試閾值就需要進行6-9次反復測量，每次需間隔10分鐘。要得到同組動物3輪閾值就需要3小時以上。

2.測試結(jié)果的“X、O”序列號易混淆
測試時，先從中間力值的纖維絲開始，將其垂直于被測區(qū)域（通常腳掌）上輕輕觸碰直到彎曲形成“C”型或“S”型。得到的X、O序列需要標準的記錄表格減小錯誤，由“X、O”序列混淆導致的計算錯誤很常見。

3.計算對數(shù)問題
Von Frey測試絲的20根絲的力值范圍為（0.008g-300g），每根絲標出的取對數(shù)值（編號）并不是等同于 log10(10F)。直接帶入試絲上的編號進行計算會存在誤差，如需取計算精確的對數(shù)值，工作量繼續(xù)加大。

4.缺乏機械穩(wěn)定性
不同克數(shù)的測試絲直徑不同，較小直徑的測試絲閾值更低。因此，需要相同彎曲力的細絲可能不代表相同的刺激強度，這使得很難比較不同實驗室的結(jié)果。

5.需要專業(yè)的技術(shù)支持
使用過程中涉及的計算和操作細節(jié)較多，一旦其中某個細節(jié)錯誤，會導致整個結(jié)果發(fā)生偏差。如帶入Xf值的含義、均差δ值計算等對于二次購買者，未掌握的情況很常見。

觸痛測試的簡化：電子測痛儀（e-VF）

一.電子測痛儀的興起

由于Von Frey纖維絲使用和計算的諸多不便加快了對新技術(shù)的開發(fā)。20世紀末，臺e-VF誕生，將其作為Von Frey纖維絲測試的改善方案。

二.Ugo Basile電子測痛儀

Ugo Basile電子測痛儀主要用于評估大小鼠觸痛閾值，與手動Von Frey纖維絲操作原理類似，不同之處在于：Von Frey纖維絲每根絲施加力值固定，判斷觸痛數(shù)秒后鼠爪縮回反應(yīng)情況，而e-VF可以施加從小至大連續(xù)的力，提供了在連續(xù)尺度上爪縮回閾值的測量（99%閾值法）。大量科學研究驗證了Ugo Basile電子測痛儀在嚙齒動物優(yōu)秀的觸痛閾值測量與Von Frey纖維絲測試結(jié)果有著高度一致性。

Ugo Basile電子測痛儀

三.Ugo Basile電子測痛儀解決了Von Frey纖維絲存在的問題

• 測試過程極大縮短，單次測試便可得到可靠測試結(jié)果
• 固定直徑的穩(wěn)定探針，使測試標準化具有可比性
• 簡化了復雜的計算方式，大大降低錯誤
• 具有三棱鏡足底觀察結(jié)構(gòu)，使用過程中無需長時間彎腰觀察刺痛位點
• 可設(shè)定參考斜率，觀察施力的穩(wěn)定性
• 設(shè)備自動校準和記錄，而Von Frey纖維絲需要面臨磨損導致的校準問題
• 測量的簡單性和快速性滿足急性炎癥或疼痛模型的測試需求

Ugo Basile動態(tài)足底測試儀（DPA）

二.Ugo Basile動態(tài)足底測試儀讓觸痛測試更簡便可靠

設(shè)備由帶有金屬針的基座、測試臺、控制主機構(gòu)成。大小鼠放置在測試平臺隔間內(nèi)，將基座上垂直固定的金屬針對準動物足底，金屬針將以預設(shè)的力量大小和變化速度對大小鼠進行刺痛。當動物出現(xiàn)縮足、舔足、跳躍等情況時，機械刺激自動停止，自動記錄疼痛閾值。

三.全自動化觸痛測量的優(yōu)勢

1.解決了觸痛測試刺激角度一致性的難點
Von Frey和e-VF都由實驗人員手持刺激，因為無法保證手動測量角度的一致性。而DPA是機械控制，刺激過程種始終角度一致。

2.解決了測試過程無法保持力度穩(wěn)定增加的難點
刺激力度的恒定和平滑增加在測試過程種非常重要，e-VF施力方式為人為主觀感覺增加力度，雖然能預設(shè)標準的參考直線，操作起來需要一定的熟練度。而DPA是程序控制始終保持增力斜率一致。

3.測試方案多樣性
Von Frey和e-VF只能測量觸痛閾值大小，在不斷創(chuàng)新的神經(jīng)科學研究中存在局限性。DPA除了可以進行閾值測量設(shè)計方案，還可以設(shè)計不同恒定力值和不同遞增力的測試方案。

4.觸痛低閾值測量的準確性
e-VF測量范圍1500g比較大，雖然可以在低閾值測量時選用50g量程范圍來減小誤差，但在測試的時候靈敏度不夠高，在效果上不如DPA。特別是在極低閾值測量時很難看出差異，波動相對較大。DPA量程較e-VF量程范圍小，很適用于大小鼠，同時增強了低閾值檢測能力和準確性

5.提高了電子測痛儀的重復性
重復性是科學研究中較為注重的一項內(nèi)容，它代表研究的說服力和被重復能力。重復性高應(yīng)當使干預因素之外的所有因素盡可能的一致。DPA嚴格按照設(shè)定程序執(zhí)行，具有優(yōu)秀的重復測試結(jié)果的能力。

應(yīng)用案例

一.實驗目的

組織炎癥常通過壓迫及釋放炎癥介質(zhì)影響感覺神經(jīng)末梢，導致疼痛發(fā)生。2021弗里德里?！啔v山大大學Fri??i? J等人發(fā)表在Immunity雜志上的“ The complement system drives local inflammatory tissue priming by metabolic reprogramming of synovial fibroblasts（IF=32.4）”為了研究反復暴露于炎癥刺激是否導致更明顯和持久的關(guān)節(jié)炎，建立了嚙齒動物雙次誘發(fā)炎癥的模型。

二.實驗結(jié)果

為了更準確地評估局部組織對炎癥誘發(fā)物的反應(yīng)機制，作者將炎癥誘發(fā)物反復注射到鼠爪中。在反復向鼠爪注射酵母多糖（Zym）、尿酸鈉（MSU)、K/BxN血清等物質(zhì)后，都出現(xiàn)了延長的關(guān)節(jié)炎現(xiàn)象，而向初次假處理的對側(cè)爪子進行二次注射炎癥誘發(fā)物則不會導致延長的關(guān)節(jié)炎和加重。

三.實驗方法：關(guān)節(jié)炎二次誘發(fā)模型注射方案

下圖為MSU晶體注射一次（-/MSU）和兩次（MSU/MSU）的BALB/c小鼠爪的時間和相對厚度關(guān)系。

四.觸痛測試方案

該研究項目使用Ugo Basile動態(tài)足底測試儀進行觸痛閾值測試。在測試之前，使動物適應(yīng)測試環(huán)境。進行測試時，通過主機設(shè)置鈍頭金屬針施加0.2 g/s的遞增力，直到動物抽搐或抬起爪子，或者直到達到8g的截止值。交替測試兩只爪子，同一只爪子的兩次測試之間至少停頓5分鐘。

五.觸痛測試結(jié)果解析

左圖：疼痛閾值雙側(cè)差異，右圖：出現(xiàn)閾值時間雙側(cè)差異，雙側(cè)差異Δ：=（MSU/MSU）處理-（-/MSU）處理。統(tǒng)計:方差分析和Dunnett檢驗。
d-1：次MSU晶體注射前；
d2：次注射后2天；
d14：第二次注射之前（注射的爪子中的關(guān)節(jié)炎消退）；
d16：第二次注射后2天。

六.Ugo Basile動態(tài)足底測試儀的在此研究中的優(yōu)勢

1.該文章中，總體實驗體量較大，其中觸覺測試就設(shè)置了多個炎癥誘發(fā)物實驗和對照組，包括前后兩次相同誘發(fā)物處理和不同誘發(fā)物交叉處理。因為多組測量要保證時效性，采用動態(tài)足底測試儀降低Von Frey纖維絲觸覺測量的工作量和干擾因素影響。

2.動態(tài)足底測試儀測量可以設(shè)置恒定的遞增力，對出現(xiàn)閾值時間分析結(jié)果顯示與前文所述的鼠爪厚度等測試結(jié)果一致，而Von Frey纖維絲和電子測痛儀無法精確控制遞增力線性和大小，此功能上存在缺陷。

3.文章設(shè)置0.2 g/s的遞增力，8g的截止值。在小鼠進行類似低閾值測試時，可以看到動態(tài)足底測試儀測試結(jié)果的優(yōu)秀重復能力和一致性，而電子測痛儀在此類實驗穩(wěn)定性較弱。

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