2023年10月华中科技大学同济医学院同济医院神经内科汪明焕团队于Nature子刊Translational Psychiatry在线发表了一篇题为“Melatonin alleviates depression-like behaviors and cognitive dysfunction in mice by regulating the circadian rhythm of AQP4 polarization”的文章，验证了褪黑素通过调节水通道蛋白4（AQP4）的昼夜节律减轻小鼠抑郁行为和认知功能障碍的机制。在实验过程中，实验者发现由于星形胶质细胞中AQP4昼夜节律调节紊乱，导致了慢性不可预测轻度应激（CUMS）小鼠在睡眠-觉醒周期中的glymphatic通路破坏，表现为CUMS小鼠白天睡眠碎片化，总睡眠时间和非快速眼动睡眠（NREM）时间减少。
在评估褪黑素通过调节AQP4昼夜节律影响小鼠睡眠质量的过程中，实验者在小鼠颅骨上植入脑电信号采集电极，并在颈部肌肉处植入肌电电极，通过头戴式装置连接到数据采集器以长时间记录小鼠的脑电（EEG）和肌电（EMG）信号，以此分析褪黑素对CUMS小鼠睡眠结构的影响。（图A）
在白天，CUMS组的总睡眠时间和非快速眼动睡眠（NREM）的持续时间减少，但褪黑素治疗组小鼠则恢复正常。在夜间，对照组、CUMS和褪黑素治疗组三组小鼠的总睡眠时间、快速眼动睡眠（NREM）和快速眼动睡眠（REM）持续时间没有差异，24小时的总睡眠时长也没有差异（图B-E）。这些结果表明，褪黑素治疗可恢复CUMS小鼠的睡眠节律，尤其对白天效果更为显著。
在评估小鼠睡眠质量方面，作者则是通过对小鼠睡眠潜伏期、睡眠持续时间和睡眠-清醒时相转变次数进行评估（图F）。与对照组相比，CUMS组的睡眠潜伏期增加，褪黑素治疗显著缩短了睡眠潜伏期（图G）。对24小时和白天记录的分析显示，CUMS组的睡眠时间缩短，并通过服用褪黑素而增强（图H）。夜间小鼠在睡眠持续时间和睡眠-清醒时相转换次数上在三组之间没有显著差异。上述结果表明，褪黑素通过增加睡眠节段持续时间而不增加睡眠节段次数的方式提高了CUMS小鼠的睡眠质量。
脑电肌电（EEG/EMG）睡眠分析的“前世今生”
汪明焕团队采用的脑电肌电采集系统研究睡眠的方法可追溯至19世纪，1929年，Hans Berger等学者便发现，从人类头皮上记录的脑电信号呈正弦波，其频率与受试者的清醒程度直接相关，这直接导致了神经科学研究者对包括人类和动物的睡眠-觉醒调节相关的神经电生理研究的进步。
随着科学技术的发展，人们对睡眠相关的神经电生理的研究也在不断产生巨大飞跃。2016年Yo Oishi等在“Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice”论文中详细阐述了啮齿动物的睡眠特征，即睡眠包括快速眼动（REM）和非快速眼动（NREM）两种模式。快速眼动睡眠的特点是脑电图呈现快速的低电压波形，主要由5.5-8.5 Hz的θ波段为主，伴随有随机的眼球运动和肌肉松弛；非快速眼动睡眠的特点则是脑电图呈现慢速的高电压波形，主要由0.5-4 Hz的δ波段为主，不伴有眼球的运动。
时至今日，脑电图（EEG）与（EMG）的记录已经是睡眠相关动物实验和临床评估必部分，该类研究可将实验对象的行为、生理学与大脑皮层神经元的活动相关联。
啮齿动物脑电肌电采集与分析的“选手”
美国Pinnacle公司生产的一站式EEG/EMG采集系统是在上述理论基础上应运而生的大小鼠睡眠研究解决方案，该系统被国内外大量脑科学研究者应用于不同的睡眠模型当中，引用文献达上千篇，得到了充分的科研实验验证。Pinnacle EEG/EMG采集系统包括有线式和无线式两种类型，并配有专业的高级睡眠分析软件Sleep Pro，用于数据采集后的睡眠离线分析。
1.硬件系统
美国Pinnacle有线式EEG/EMG系统采用低扭矩万向转向设计规避动物活动对数据采集线缆产生扭转、缠绕等现象，保证动物信号采集过程活动不受影响。的头戴式前置放大器设计将脑电信号进行放大和过滤，旨在降低信号伪影（包括运动伪影），再加上数据采集器进行二次数据放大和过滤，从而可获得异常干净的数据波形。
2.植入耗材
在脑电和肌电植入操作上，Pinnacle建议将分别植入颅骨前囟点前后2-3mm的位置，在此位置可记录到较为明显的动物前额叶皮层的脑电信号，而在肌电植入时，根据动物睡眠与清醒颈背肌肉放电存在显著差异，实验中肌电电极均会在颈部肌肉处植入。按上述方法在动物头部安装采集脑电肌电的头戴式头帽，方便后续连接信号采集器采集数据。Pinnacle除了提供大小鼠脑电肌电采集硬件系统，还提供全套脑电肌电植入耗材以及操作器械，方便用户快速上手操作，加快实验进度。
3.专业版睡眠分析软件
Pinnacle还配套专业版睡眠分析软件Sirenia Sleep Pro，通过动物脑电δ波、θ波以及肌电信号的强弱，基于多种评分工具，对动物各睡眠时相进行快速准确的评分分析，获得动物睡眠觉醒时相图、睡眠时长、觉醒次数等睡眠相关数据。经Sleep Pro软件分析获得的数据准确性达90%以上，15min内即可对动物24h脑电数据进行完整分析，是目前国际上高效和准确的睡眠分析软件之一。
Sirenia Sleep Pro具有自动化的睡眠统计分析功能，可对动物睡眠的不同时相进行时间统计，包括清醒、REM和NREM的时间、数量和百分比统计，用于分析动物的不同睡眠节段的时长；睡眠节段包括动物不同睡眠时相的切换次数和切换时间间隔可评估动物的睡眠质量。用户可一键生成统计图或自定义生成图表，多种数据呈现方式有利于文献的发表。
除了有线式EEG/EMG采集系统，Pinnacle还推出了一款无线式EEG/EMG系统，该系统利用轻巧的无线稳压器装置在动物头部即完成脑电肌电信号等数字化处理，并通过蓝牙传输至电脑采集软件进行处理分析。无线式EEG/EMG系统消除了传统有线式设备对于动物活动的限制，使动物更加接近于其生理状态，特别适合与迷宫、探洞等行为学实验联合使用。
上海玉研科学仪器有限公司与美国Pinnacle公司保持长期友好合作关系，我们致力于研发和引进的科学仪器，为国内外实验室建设、课题研究推荐科学合理的解决方案，并提供最真诚可靠的技术服务。
更多案例
案例1
2017年霍普金斯大学医学院神经科学系Kai Liu等研究者在Nature上发表了题为“Lhx6-positive GABA-releasing neurons of the zona incerta promote sleep”的高分文章，实验者采用Pinnacle EEG/EMG采集系统验证了下丘脑腹侧核带GABA能神经元释放的Lhx6因子对睡眠有促进作用。
实验中，研究者使用Pinnacle 4通道有线式2EEG/1EMG/1BIO系统，通过在小鼠头骨上锚定螺钉电极（用于记录EEG1信号的两个前螺钉的位置分别为：AP:+2 mm，ML:±1.5 mm。用于记录EEG2信号的两只后螺钉的位置为：AP:−4 mm，ML：±1.5 mm），并将两个EMG电极插入小鼠左右颈部肌肉，然后用牙科水泥固定头帽和电极。待动物恢复10天左右将动物放入12h-12h昼夜节律的记录室中，动物在其中适应5-7天后使用 Pinnacle Sirenia acquisition基础软件记录小鼠的脑电肌电信号。
Pinnacle EEG/EMG系统采集的实验组和对照组的小鼠脑电图，图中显示了清醒阶段（黄色），快速眼动睡眠阶段（红色）和非快速眼动睡眠阶段（紫色），以及实时睡眠图、FFT生成的δ功率图、EEG频谱图以及EEG/EMG原始图。
案例2
2022年哈佛医学院精神病学系David S. Uygun等在Nature上发表了题为“Knockdown of GABAA alpha3 subunits on thalamic reticular neurons enhances deep sleep in mice”的高分文章，探究丘脑网状神经元GABAAα3亚基对深度睡眠的影响。实验中为了记录小鼠皮层脑电，研究者采用Pinnacle 2EEG/EMG系统，将EEG螺旋电极分别植入AP+1.9 mm，ML±1.5点，参考电极植入AP−3 mm，ML+2.7，接地电极植入AP−6 mm， M L=0处，并将电极焊接在头帽上，然后将EMG电极植入到小鼠颈部肌肉中，最后用牙科水泥固定头帽和电极。动物恢复一周后分别在注射AAV前后记录小鼠的EEG/EMG信号，并用Sleep pro离线睡眠分析软件进行了睡眠阶段分析。
与对照组相比，α3KD小鼠和α1KD小鼠实验组小鼠的NREM持续时间和次数没有显著改变；在α3KD小鼠中，持续<60 s的时间节段比例显著减少，而α1KD小鼠组小鼠与对照组之间没有显著差异。
扩展阅读
[1].Yao, D., et al., Melatonin alleviates depression-like behaviors and cognitive dysfunction in mice by regulating the circadian rhythm of AQP4 polarization. Translational Psychiatry, 2023. 13(1): p. 310.
[2].Uygun, D.S., et al., Knockdown of GABAA alpha3 subunits on thalamic reticular neurons enhances deep sleep in mice. Nature communications, 2022. 13(1): p. 2246.
[3].Liu, H., et al., Microglia modulate stable wakefulness via the thalamic reticular nucleus in mice. Nature Communications, 2021. 12(1): p. 4646.
[4].Wang, D., et al., GABAergic Neurons in the Dorsal–Intermediate Lateral Septum Regulate Sleep–Wakefulness and Anesthesia in Mice. Anesthesiology, 2021. 135(3): p. 463-481.
[5].Xing, L., et al., Mutant neuropeptide S receptor reduces sleep duration with preserved memory consolidation. Science translational medicine, 2019. 11(514): p. eaax2014.
[6].Jiang-Xie, L., et al., A common neuroendocrine substrate for diverse general anesthetics and sleep. Neuron, 2019. 102(5): p. 1053-1065. e4.
[7].Liu, K., et al., Lhx6-positive GABA-releasing neurons of the zona incerta promote sleep. Nature, 2017. 548(7669): p. 582-587.
[8].Ehlen, J.C., et al., Bmal1 function in skeletal muscle regulates sleep. Elife, 2017. 6: p. e26557.
[9].Anaclet, C., et al., Basal forebrain control of wakefulness and cortical rhythms. Nature communications, 2015. 6(1): p. 8744.
[10].Anaclet, C., et al., The GABAergic parafacial zone is a medullary slow wave sleep–promoting center. Nature neuroscience, 2014. 17(9): p. 1217-1224.
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