大體解剖組織透明化的概念在一個(gè)多世紀(jì)前就被提出了, 但是直到最近才在顯微成像領(lǐng)域開(kāi)始流行。隨著現(xiàn)代光學(xué)物理和化學(xué)應(yīng)用的發(fā)展，尤其對(duì)大樣品進(jìn)行單細(xì)胞分辨率成像的顯微技術(shù)不斷成熟,  以及能對(duì)超大數(shù)據(jù)進(jìn)行保存和分析的計(jì)算資源的涌現(xiàn)，他們共同驅(qū)動(dòng)了大組織透明化這個(gè)概念的復(fù)興。由于對(duì)生物結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)聯(lián)的研究一般都需要三維成像, 所以組織透明化有很大潛力解鎖很多生物科學(xué)新發(fā)現(xiàn)。但是, 目前有關(guān)這方面的文獻(xiàn)相對(duì)復(fù)雜, 讓新入門的研究人員望而卻步。

本篇由光片專家鄭超主要根據(jù)Alba Vieites-Prado and Nicolas Renier的綜述“Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology”和其它透明化文獻(xiàn)進(jìn)行編譯整理總結(jié)。目的是勾勒出透明化研究的模塊框架, 使得對(duì)透明化感興趣的研究人員有能力開(kāi)發(fā)針對(duì)自己應(yīng)用的透明化方法。另外, 也會(huì)提到大規(guī)模透明化需要的成像和計(jì)算資源, 概述目前透明化技術(shù)的主要應(yīng)用, 并對(duì)透明化技術(shù)目前的局限性以及以后的發(fā)展前景做簡(jiǎn)單的討論。

  應(yīng)  用   

在常規(guī)切片以外， 透明化為大生物樣品的分析提供了一個(gè)非常好的途徑。相比于切片，透明化一般在制樣時(shí)費(fèi)時(shí)更久，因?yàn)樾枰诓煌娜芤褐信囵B(yǎng)并染色。但是這些過(guò)程一般不需要太多的人工干預(yù)， 也不需要復(fù)雜的專業(yè)技能。透明化也不需要類似于切片機(jī)之類的專業(yè)工具， 并且支持大規(guī)模并行處理。最重要的是， 組織透明化杜絕了對(duì)樣品的機(jī)械損傷，并且對(duì)計(jì)算資源的需求相對(duì)于復(fù)雜的切片重組要簡(jiǎn)單很多。對(duì)于密集的樣品， 透明化可以提供更精確的計(jì)算結(jié)果。最后，透明化也可以完成傳統(tǒng)切片無(wú)法完成的一些應(yīng)用，比如對(duì)跨越整個(gè)器官或者組織的追蹤（比如長(zhǎng)距離神經(jīng)追蹤，癌癥轉(zhuǎn)移路徑等）。

生物應(yīng)用層面，透明化的應(yīng)用也是非常廣泛。主要的應(yīng)用集中在神經(jīng)科學(xué)，腫瘤學(xué)和心血管學(xué)。噬齒類動(dòng)物幾乎每個(gè)器官包括腦、腸、脾、淋巴結(jié)、心、腎、肺、眼和骨等都已經(jīng)被透明化了 。其他模式動(dòng)物和非模式動(dòng)物包括魚(yú)和蠑螈等也都已經(jīng)被透明化。體外模型包括3D細(xì)胞球體和類器官等的尺寸也一直在增大（幾個(gè)毫米的直徑）也需要組織透明化來(lái)進(jìn)行完整的3D觀察。最后，透明化以及相關(guān)的成像技術(shù)也越來(lái)越成熟。

 神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用 

包括老鼠和人在內(nèi)的很多生物中，神經(jīng)都是身體的細(xì)胞， 最長(zhǎng)可以到幾個(gè)厘米。這個(gè)尺寸決定了要研究它們就必須對(duì)整個(gè)器官甚至生物體進(jìn)行研究，可以通過(guò)切片或者透明化。神經(jīng)系統(tǒng)組織富含脂質(zhì)， 色素和胞體外蛋白，比如膠原蛋白和彈性蛋白，因其含量很低， 所以極為適合透明化，去脂之后就只剩下稀疏的蛋白結(jié)構(gòu)了。水基和基于有機(jī)溶劑的透明化方案都已經(jīng)被證明可以對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行透明化，不過(guò)對(duì)于高脂密度區(qū)域結(jié)合兩種方法同時(shí)使用， 比如脊髓和大腦中的有髓軸突。

神經(jīng)科學(xué)研究的主要目標(biāo)是剖析完整的大腦接線圖，這個(gè)領(lǐng)域被稱為連接組學(xué)。即使在透明化之后，神經(jīng)元的密度依然會(huì)超過(guò)熒光顯微鏡的分辨率極限， 常見(jiàn)的做法是通過(guò)稀疏標(biāo)記的神經(jīng)元集合來(lái)創(chuàng)建區(qū)域投影， 包括在細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子控制下的基因編碼熒光蛋白和用特定細(xì)胞類型的已知標(biāo)記物進(jìn)行免疫標(biāo)記。熒光蛋白的表達(dá)可能涉及每種細(xì)胞類型的單一熒光蛋白，可能使用多種熒光蛋白的組合表達(dá)，以便能夠識(shí)別數(shù)百個(gè)單個(gè)細(xì)胞（例如Brainbow和其他類似方法）。熒光蛋白的表達(dá)可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因或者攜帶熒光蛋白編碼DNA的病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)。狂犬病毒和腺相關(guān)病毒（AAV）通常用于轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞：例如，將AAV載體的組合直接注射到小鼠的大腦中，以確定中腦多巴胺神經(jīng)元的支配模式。一個(gè)創(chuàng)傷性較小的方法是使用AAV載體，它可以被注射到血液中并感染大腦的特定細(xì)胞類型。為了幫助分析透明化組織中的稀疏標(biāo)記的神經(jīng)元，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了空間神經(jīng)元追蹤算法，可以進(jìn)行手動(dòng)或半自動(dòng)的分割。的全自動(dòng)算法，如NeuroGPS-Tree，在厚的透明化組織切片中追蹤了1000多個(gè)神經(jīng)元，還有一個(gè)稱為BIRDS的軟件，它使用深度學(xué)習(xí)來(lái)進(jìn)行長(zhǎng)距離的神經(jīng)元投影追蹤和不同腦區(qū)的細(xì)胞群的平行計(jì)數(shù)。

組織透明化也被用來(lái)繪制生物體執(zhí)行某種行為或受到某種刺激后的大腦活動(dòng)區(qū)域。大腦活動(dòng)可以通過(guò)免疫染色激發(fā)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物來(lái)推斷，如Fos。如果Fos出現(xiàn)在一個(gè)神經(jīng)元中，這表明它最近被激活。使用這種方法，通過(guò)感知刺激或者觀察小鼠的養(yǎng)育行為，在透明化大腦中完成了腦區(qū)活動(dòng)圖譜的繪制。

最后，組織透明化顯示了幫助神經(jīng)相關(guān)病理研究的潛力。最近，SWITCH透明化和免疫標(biāo)記方法用來(lái)研究可以導(dǎo)致阿爾茨海默癥發(fā)病和發(fā)展的amyloid-β（Aβ）肽在全腦范圍的標(biāo)記和成像。這種方法允許對(duì)Aβ斑塊進(jìn)行微觀測(cè)繪，并確定了幾個(gè)新的皮層下Aβ積累的中心。

迄今為止，大腦透明化主要集中在嚙齒動(dòng)物組織上，因?yàn)槿祟惤M織的幾個(gè)問(wèn)題：較強(qiáng)的自發(fā)熒光、長(zhǎng)期保存造成的過(guò)度固定和較大的物理尺寸。最近，更新過(guò)的SHANEL和ELAST透明化協(xié)議可以對(duì)人類全腦進(jìn)行透明化。在這一領(lǐng)域存在許多令人興奮的應(yīng)用。

 腫瘤學(xué)應(yīng)用 

使用CUBIC或vDISCO技術(shù)進(jìn)行全動(dòng)物透明化，能夠以單細(xì)胞分辨率觀察整個(gè)嚙齒動(dòng)物的微轉(zhuǎn)移灶。此外，通過(guò)對(duì)治療性抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，可以檢測(cè)整個(gè)動(dòng)物體內(nèi)接受治療的轉(zhuǎn)移部位的百分比。

在癌癥病理學(xué)領(lǐng)域，人們對(duì)三維樣本是否比傳統(tǒng)的二維手術(shù)取樣技術(shù)提供更準(zhǔn)確的診斷或預(yù)后感興趣。一種被稱為ExPATH（expansion microscopy）的技術(shù)，對(duì)乳腺癌患者的透明化活檢樣本進(jìn)行成像，能夠比手術(shù)取樣更好地區(qū)分早期乳腺腫瘤性病灶。PathoDISCO可以在不到48小時(shí)內(nèi)對(duì)手術(shù)切除的大型（30 × 20 × 5毫米）乳腺腫瘤樣品進(jìn)行透明化；PathoDISCO的關(guān)鍵步驟是使用2，2-二甲氧基丙烷與水反應(yīng)生成丙酮和甲醇，迅速使組織脫水。

圍繞組織的微環(huán)境是高度異質(zhì)性的，并影響其生長(zhǎng)和發(fā)展。水凝膠包埋協(xié)議已被證明可以保留發(fā)育中乳腺組織周圍微環(huán)境的重要元素，并對(duì)其進(jìn)行三維研究。通過(guò)這種方式，CUBIC組織透明化方法通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中的多細(xì)胞相互作用進(jìn)行分析，揭示了TGFβ在腫瘤微環(huán)境中的作用。

對(duì)新型非脂質(zhì)納米顆粒的研究顯示，基于溶劑的和水基的透明化技術(shù)都允許這些納米顆粒在組織中保留，這些納米顆粒是潛在的治療劑遞送載體。這些研究表明，組織透明化可用于測(cè)量新型癌癥治療藥物的生物分布。

 心血管研究應(yīng)用 

血管在通過(guò)灌注標(biāo)記試劑進(jìn)行透明化之前很容易被標(biāo)記。目前使用過(guò)的標(biāo)記包括針對(duì)排列在血管上的目標(biāo)分子抗體、小麥胚芽凝集素和埃文斯藍(lán)，或親脂性染料。重要的是，任何染色標(biāo)記都必須包含能與固定劑（如PFA）反應(yīng)的分子，否則會(huì)在隨后的透明化過(guò)程中被洗掉。

組織透明化可以研究全身任何器官在發(fā)育過(guò)程中或受傷后的血管修復(fù)和重塑；特別令人感興趣的是在動(dòng)脈瘤和中風(fēng)的情況下對(duì)大腦血管破裂以及對(duì)心肌梗塞的研究?，F(xiàn)在，心血管研究得到了一些半自動(dòng)的血管分割技術(shù)的幫助，這些技術(shù)已經(jīng)在商業(yè)和定制軟件中開(kāi)發(fā)出來(lái)，用于分析透明化小鼠大腦中的感興趣區(qū)域。但是這些方法不足以可靠地檢測(cè)不同腦區(qū)不同信噪比的毛細(xì)血管，也不足以在全腦或器官水平上系統(tǒng)地分析血管的改變?；跈C(jī)器學(xué)習(xí)的策略克服了這些障礙，目前有兩種基于機(jī)器學(xué)習(xí)的方法（VesSAP和TubeMap）可用于可靠地檢測(cè)、分割并與標(biāo)記全腦血管的Allen腦圖譜進(jìn)行比對(duì)。最近，組織透明化也被用于繪制控制小鼠心率的副交感和交感神經(jīng)回路，產(chǎn)生大鼠內(nèi)在心臟神經(jīng)系統(tǒng)的單神經(jīng)元尺度圖，并量化小鼠心肌梗塞后的交感神經(jīng)過(guò)度支配。