摘 要：簡介比濁法和活菌計數(shù)法測定菌液濃度的操作步驟和優(yōu)缺點，將比濁法與活菌計數(shù)法相結(jié)合，測定了常見模式菌株比濁度對應(yīng)的活菌計數(shù)濃度，為菌種濃度的預(yù)估提供一個快速，準確，便捷的方法。

　　關(guān)鍵詞：菌液濃度;活菌計數(shù);比濁度

　　在微生物檢驗工作中，比如藥品微生物限度檢查方法驗證、防腐效力測試、消毒液消毒效果驗證、培養(yǎng)基適用性檢查等等，常常需要加入一定濃度的菌懸液，菌液濃度過高或過低都將影響測試結(jié)果的準確性，因此控制菌液濃度是必要且關(guān)鍵的一步。測定菌液濃度的方法一般有三種，其一為活菌計數(shù)法，此法能準確判斷菌液濃度，是目前國內(nèi)的仲裁法，但是該法需要培養(yǎng)后計數(shù)，有明顯的滯后性;其二為顯微鏡觀察法，該方法適用于菌體較大的菌種濃度的測定，如霉菌和酵母菌，具有方便快捷的優(yōu)點，但不適用于菌體細小的菌種濃度的測定，有較大的局限性;三為比濁法，此法能快速地判斷菌液濃度，但結(jié)果為粗略的估計值，不同大小的菌種其形成的光密度不同，因此同一個比濁度，不同的菌結(jié)果差異較大，準確性不高。

　　本文具體介紹將比濁法和活菌計數(shù)法相結(jié)合的測定方法，測定了常見模式菌株1麥氏比濁度(MCFARLAND)的菌液濃度，用于指導(dǎo)日常微生物檢測工作中菌液濃度的快速、準確測定，具有較強的實用價值。

　　一、菌種及菌液的制備

　　1.菌種

　　(Staphylococcus aureus ATCC 6538)

　　銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)

　　大腸埃希菌(Escherichia coli ATCC 8739)

　　枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilisATCC 6633)

　　(Salmonella paratyphiCMCC(B)50094)

　　白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10231)

　　黑曲霉(Aspergillusniger ATCC 16404)

　　以上菌種從廣東省微生物菌種保藏中心采購，經(jīng)復(fù)蘇兩代至五代內(nèi)使用。

　　2.菌液的制備

　　(1)將、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、的凍干管封口端(即遠離凍干粉的一端)在火焰上分別灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內(nèi)用滅菌鑷子輕輕掰開裂口，分別用0.5mL TSB溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株全部轉(zhuǎn)移到10mL TSB中，置36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時，此為代菌種。在生物安全柜內(nèi)分別用無菌接種環(huán)挑取1接種環(huán)代上述菌懸液分別劃線接種于TSA中然后置于36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時，此為第二代菌種，備用。

　　(2)將白色念珠菌凍干管封口端在火焰上灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內(nèi)用滅菌鑷子輕輕掰開裂口，用0.5mL改良馬丁液體培養(yǎng)基溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株全部轉(zhuǎn)移到10mL 改良馬丁液體培養(yǎng)基中，置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時，此為代菌種。在生物安全柜內(nèi)無菌接種環(huán)挑取1接種環(huán)代菌懸液劃線接種于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中。將新鮮接種的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時，此為第二代菌種，備用。

　　(3)將黑曲霉凍干管封口端在火焰上灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內(nèi)用滅菌鑷子輕輕掰開裂口，用0.5mL含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株劃線接種到改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，此為代菌種。在生物安全柜內(nèi)，用無菌接種環(huán)挑取1接種環(huán)代黑曲霉劃線接種于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中。然后置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，此為第二代菌種。向第二代黑曲霉菌種管內(nèi)加入5ml含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液，用無菌接種環(huán)將孢子洗脫，吸出孢子懸液(用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管)至無菌試管內(nèi)，備用。

　　二、培養(yǎng)基和儀器

　　1.培養(yǎng)基

　　(1)商品培養(yǎng)基。

　　胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)瓶裝顆粒培養(yǎng)基

　　胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)

　　改良馬丁液體培養(yǎng)基

　　改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

　　0.5%無菌T.T.C

　　以上培養(yǎng)基從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司采購商品培養(yǎng)基，按產(chǎn)品說明書配制，滅菌后備用，其中TSA在使用前每100mL培養(yǎng)基加入1mL0.5%無菌T.T.C以便于細菌菌落的觀察。

　　(2)按配方配制的培養(yǎng)基。

　　0.85%氯化鈉

　　0.9%氯化鈉

　　含0.05%吐溫80的0.9%氯化鈉

　　以上培養(yǎng)基按配方配制，滅菌后備用。

　　2.儀器

　　生物安全柜(型號：SBSC1600ⅡB2)

　　恒溫培養(yǎng)箱(36±1℃，28±2℃)

　　麥氏比濁儀(產(chǎn)品貨號：WGZ-XT，生產(chǎn)商：豐臨)

細菌濁度儀WGZ-XT

　　漩渦混合器(型號：QA-1)

　　三、菌種比濁度的測定及調(diào)節(jié)

　　1.按儀器使用說明書操作，用標準麥氏比濁管檢定儀器，當不同濃度的麥氏比濁管讀數(shù)與標準麥氏比濁管標定的值在誤差允許范圍內(nèi)時，方可進行下一步驟。

　　2.用0.85%無菌氯化鈉作為空白，調(diào)零。

　　3.分別用無菌接種環(huán)挑取1.2.1和1.2.2的平板上菌落適量，分別在裝有5mL 0.85%氯化鈉的50mL錐形瓶瓶壁上將菌分散(蘸取少量氯化鈉后在瓶壁上來回劃線，以便將菌分散后使之易于混勻)，然后用混合器將菌液混勻備用。

　　4.測定菌液比濁度，用相應(yīng)菌種的菌落或氯化鈉調(diào)節(jié)菌液的濃度，使菌液比濁度讀數(shù)約為1MCFARLAND。

　　四、活菌計數(shù)法計數(shù)各菌種1 MCFARLAND的菌含量

　　1.、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、在生物安全柜內(nèi)進行操作。用0.85%無菌氯化鈉作為稀釋劑，10倍梯度逐級稀釋至10-7，分別依次測定每種菌10-5～10-7三個稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)。用移液槍及滅菌移液槍頭各吸取1mL注入滅菌平皿中，每種菌每個梯度制備2個平行。注入約20mL，45℃～50℃的TSA培養(yǎng)基，隨即轉(zhuǎn)動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，然后進行菌落計數(shù)。先用肉眼觀察，必要時可用放大鏡，點計菌落數(shù)，記下各平皿的菌落數(shù)后，求出每種菌的平均菌落數(shù)，換算成每種菌1 MCFARLAND的菌含量。

　　2.白色念珠菌和黑曲霉在生物安全柜內(nèi)進行操作，白色念珠菌用0.85%無菌氯化鈉作為稀釋劑，黑曲霉用0.9%無菌氯化鈉作為稀釋劑，10倍梯度逐級稀釋至10-6，每種菌分別測定10-4～10-6三個稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)。用移液槍及滅菌移液槍頭各吸取1mL注入滅菌平皿，每種菌每個梯度制備2個平行。注入約20mL，45℃～50℃的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，隨即轉(zhuǎn)動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置28℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h后，進行菌落計數(shù)。先用肉眼觀察，必要時可用放大鏡，點計菌落數(shù)，記下各平皿的菌落數(shù)后，求出每種菌的平均菌落數(shù)，換算成每種菌1 MCFARLAND的菌含量。

　　五、結(jié)果與討論

　　每種菌獨立重復(fù)三次實驗，計算三次重復(fù)實驗每種菌1MCFARLAND所含的平均菌落數(shù)。結(jié)果如下表：

　　由表1可以看到：、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、、白色念珠菌以及黑曲霉每1MCFARLAND采用活菌計數(shù)法計數(shù)所得的菌液含量具有良好的重現(xiàn)性，三次獨立重復(fù)實驗測定的菌液含量相對偏差小于50%。菌液的比濁度的菌液體的大小有有關(guān)，菌體越大，相同比濁度的菌液含量越少。

　　六、結(jié)論

　　通過本實驗證實，菌液含量(CFU/mL)與菌液的比濁度(MCFARLAND)有良好的相關(guān)性，可將實驗用菌懸液調(diào)節(jié)至1MCFARLAND，通過活菌計數(shù)法確定實驗用菌懸液的含量，以便較準確的預(yù)估實驗用菌株濃度及所需要稀釋的級別。用平板制備的菌落，可采用適宜的稀釋劑作為比濁儀的空白對照，調(diào)零。此方法特別適用于枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞桿菌等在液體培養(yǎng)基上易形成塊狀或絮狀物等不易打散的菌液的計數(shù)。若采用液體培養(yǎng)基增菌的菌液則用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基作為比濁儀的空白對照，調(diào)零。

　　由于實驗室間條件差異;培養(yǎng)基產(chǎn)地、批號不同;操作人員與系統(tǒng)誤差等原因，同一菌種比濁度對應(yīng)的菌液含量會有一定差異，建議在同一實驗室一旦有因素變化，應(yīng)再重新確定菌種比濁度對應(yīng)的菌液含量。

　　參考文獻：

　　[1]朱艷靜，李宇.測定菌體濃度的簡便方法[J].上海市工業(yè)微生物研究所，2002，第36卷第4期：47-49.

　　[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[ M ].四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版，2015： 1105.

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