田曉然，付廷明“，郭立瑋

（南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥復(fù)方分離工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210029）

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[摘要] 目的：考察濕法超微粉碎-超濾法快速提取濃縮全蝎蛋白的可行性。方法：利用大鼠體內(nèi)抗凝血、抗血栓藥效試驗(yàn)比較濕法超微粉碎-超濾法、酶解法2種提取工藝所得全蝎蛋白的藥效差異，以考察濕法超微粉碎-超濾法用于全蝎蛋白提取濃縮的可行性。結(jié)果：2種提取方法所得全蝎蛋白均能明顯延長(zhǎng)大鼠凝血時(shí)間、血漿活化部分時(shí)間、原時(shí)間、時(shí)間，并對(duì)大鼠動(dòng)靜脈血栓干、濕重均有明顯減輕作用，與生理鹽水對(duì)照組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：經(jīng)大鼠體內(nèi)抗凝血、抗血栓藥效試驗(yàn)驗(yàn)證，采用濕法超微粉碎-超濾法快速提取濃縮全蝎蛋白是可行的。

[關(guān)鍵詞]全蝎；濕法超微粉碎；超濾法；抗凝血；抗血栓

[中圖分類號(hào)] R283.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1005-9903(2012)22-0013-04

Feasibility Investigation of Extraction and Concentration Technology For Protein from Buthus martensii Rapidly by Wet Superfine Grinding-Ultrafiltration Method

TIAN Xiao-ran, FU Ting-ming”, GUO Li-wei

(Key Laboratory of Isolation Engineering for Compound Chinese Materia Medica,

Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China)

[Abstract] Objective: To investigate feasibility of extraction and concentration technology for protein from Buthus martensii rapidly by wet superfine grinding-ultrafiltration method. Method: Pharmacodynamic difference of protein from B. martensii was compared by in vivo anticoagulant and in vivo antithrombotic experiments in rats, which were prepared by two different extraction technology (wet superfine grinding-ultrafiltration method and pepsin enzymatic hydrolysis method), in order to investigate feasibility of extraction and concentration for protein from B. martensii by wet superfine grinding-ultrafiltration method. Result: Protein from B. martensi through two kinds of extraction methods could both significantly prolong blood coagulation time and plasma APTT,PT,TT of rats. Furthermore, they could reduce dry and wet weight of rat arteriovenous thrombosis significantly,compared with physiological saline control group, there were statistically significant difference. Conclusion: After approved by in vivo anticoagulant and in vivo antithrombotic experiments in rats, it was feasible of wet superfine grinding-ultrafiltration method used to extract and concentrate protein from B. martensii rapidly.

[Key words] Buthus martensii; wet superfine grinding; ultrafiltration method; anticoagulation; antithrombotic

全蝎性味辛、平，有毒，歸肝經(jīng)，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛的功效[1]。臨床多入丸、散劑，其次入水煎劑?，F(xiàn)代研究表明，全蝎主要藥效成分為全蝎蛋白[2]，具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗癲癇、抗血栓[3]等藥理作用。目前全蝎蛋白的提取采用水煎煮、醇提法及酶解法等，其中酶解法應(yīng)用。將濕法超微粉碎提取技術(shù)應(yīng)用于全蝎蛋白提取目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，將超濾法應(yīng)用于全蝎蛋白的濃縮過(guò)程亦無(wú)報(bào)道。本試驗(yàn)嘗試將濕法超微粉碎提取法和超濾法耦合應(yīng)用于全蝎蛋白的提取、濃縮過(guò)程中，通過(guò)比較該法與酶解法所得蛋白在大鼠體內(nèi)的抗凝血、抗血栓活性，確定濕法超微粉碎-超濾法快速提取濃縮全蝎蛋白的可行性。

1材料

Anke TGL-16C型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），濕法超微粉碎機(jī)（自制），聚醚膜（PES，sepro公司），LG-PAPER-1型血小板聚集及分析儀（北京世帝科學(xué)儀器公司），LIBROR AEL-40SM型精密電光分析天平（日本島津）。全蝎購(gòu)自安徽省亳州市永剛飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物鑒定教研室劉訓(xùn)紅教授鑒定為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎 Buthus martensüi Karsch的干燥體，置于30℃真空干燥箱干燥備用。鈉（上海信誼藥廠有限公司，批號(hào)111003），（1:3000，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），TT試劑（10 mLx2mL，南京建成生物工程有限公司），PT試劑（10mLx2mL，南京建成生物工程有限公司），APTT試劑（10mL×2mL，南京建成生物工程有限公司），生理鹽水（南京小營(yíng)藥業(yè)股份有限公司），人工胃液（取鹽酸9mL，加蒸餾水稀釋成1L），硫酸銨（南京化學(xué)試劑有限公司）。SD大鼠，雌雄各半，體重約180~220g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，符合國(guó)家健康一級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005。

2方法與結(jié)果

2.1全蝎蛋白的提取

2.1.1濕法超微粉碎-超濾法 取全蝎粗粉，加12倍量水浸泡1h，濕法超微粉碎5 min，10000r·min-1離心10 min，將離心液輸入超濾膜設(shè)備中，超濾濃縮至1g·mL-1的濃縮液（中空纖維膜選擇外壓式 PES膜，膜孔徑相對(duì)分子量6000，壓力0.5 Mpa,流速500 mL·min-1）。向濃縮液中緩慢加入（NH、）2S0、飽和液至其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%，放置過(guò)夜。10000r·min-1離心10min，保留沉淀蛋白。加水將沉淀蛋白溶解至1g·L-1，備用。

2.1.2酶解法取全蝎細(xì)粉，加入人工胃液（固液比1：20），密閉，于37℃恒溫水浴30 min,加3.0%水解3h，酶解液用0.1 mmol·LnaOH溶液調(diào)節(jié)pH7.4,終止酶解反應(yīng)。10000 r·min-1離心10 min，取上清液，加熱濃縮至1g·mL-1。向濃縮液中緩慢加入（NH）2S0、飽和液至其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%，放置過(guò)夜。10000 r·min-1離心10min，保留沉淀蛋白。加水將沉淀蛋白溶解至1g·L-1，備用。

2.2全蝎蛋白對(duì)凝血系統(tǒng)的影響比較

2.2.1凝血時(shí)間（CT）比較[4]

取SD大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只。分生理鹽水對(duì)照組、鈉陽(yáng)性對(duì)照組、濕法超微粉碎-超濾法組（低、高劑量組）、酶解組。陽(yáng)性對(duì)照組給藥質(zhì)量濃度為0.0733g·L-1，濕法組給藥質(zhì)量濃度分別為0.5（濕法低劑量組），1g·L-1（濕法高劑量組），酶解組（酶解組）給藥質(zhì)量濃度為1g·L-1，空白對(duì)照組給予同體積生理鹽水，按20 mL·kg-1灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7d。末次給藥1 h后，用內(nèi)徑1mm的玻璃毛細(xì)管插入大鼠眼眶內(nèi)眥靜脈叢取血，至毛細(xì)管血柱達(dá)30mm，每隔30s折斷毛細(xì)管一段，檢查有無(wú)出現(xiàn)凝血絲，記錄毛細(xì)管采血到出現(xiàn)凝血絲的時(shí)間，結(jié)果凝血時(shí)間分別為(39.4±6.7),(145.2±7.8),（70.2±8.2）,（135±7.2），（106±20.0）s。說(shuō)明與生理鹽水組相比，濕法組與酶解組對(duì)大鼠CT的延長(zhǎng)均有非常顯著性差異（P<0.01）。且濕法組對(duì)大鼠CT的延長(zhǎng)呈量效依賴關(guān)系，確定其對(duì)大鼠的抗凝血機(jī)制產(chǎn)生明顯的影響。

2.2.2 時(shí)間（TT）比較 取SD大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只。分生理鹽水對(duì)照組、鈉陽(yáng)性對(duì)照組、濕法超微粉碎-超濾法組（分低、高劑量）、酶解組。按2.2.1項(xiàng)下方法給藥，大鼠給藥7d，頸總動(dòng)脈取血，3000 r·min-1離心10 min，得貧血小板血漿（PPP），即待測(cè)血漿。取待測(cè)血漿100pL放入上的測(cè)試槽中，與37℃保持3min，加入37℃已預(yù)溫100 pL，立即開(kāi)始測(cè)定，記錄凝固時(shí)間。每只大鼠血漿平行做8次，取平均值分別為(13.2±1.0),(120±30.7),(26.0±0.6)，（30.5±1.4），（27.2±1.3）s。說(shuō)明濕法組和酶解組均能明顯延長(zhǎng)大鼠血漿TT，與生理鹽水組相比有非常顯著性差異（P<0.01）。同時(shí)，濕法組對(duì)大鼠血漿TT的延長(zhǎng)有量效依賴關(guān)系，影響了凝血機(jī)制的共同途徑。

2.2.3 原時(shí)間（PT）比較 取2.2.2項(xiàng)下待測(cè)血漿50 μL放入測(cè)試槽中，37℃保持3min，加入37℃已預(yù)溫 PT試劑50pL，立即開(kāi)始測(cè)定，記錄凝固時(shí)間。每只大鼠血漿平行做8次，取平均值依次為(12.0± 0.46),(123.1 ± 20.1)，(15.0± 0.66),（20.7±0.53），（18.9±0.99）s。說(shuō)明濕法組和酶解組均能明顯延長(zhǎng)大鼠血漿PT，與生理鹽水組相比呈顯著性差異（P<0.01）。濕法組對(duì)大鼠血漿PT的延長(zhǎng)有量效依賴關(guān)系，對(duì)外源性凝血途徑有顯著作用。

2.2.4活化部分時(shí)間（APTT）比較在測(cè)試槽中，將已預(yù)溫 APTT試劑100pL，與預(yù)溫3min的2.2.2項(xiàng)下待測(cè)血漿混合，孵育3min后加入預(yù)溫37℃的CaCl100 μL，立即開(kāi)始測(cè)定，記錄凝固時(shí)間。每只大鼠血漿平行做8次，取平均值分別為(22.1±0.73)，（128.7±23.3）,（33.5±2.6）,（41.4±2.1）,（39.8±0.78）s。說(shuō)明濕法組和酶解組均能明顯延長(zhǎng)大鼠血漿APTT，與生理鹽水組相比均有顯著性差異（P<0.01）。濕法組對(duì)大鼠血漿PT的延長(zhǎng)有量效依賴關(guān)系，并對(duì)抑制了凝血途徑中的內(nèi)源性凝血過(guò)程。

2.3全蝎蛋白體內(nèi)抗血栓作用比較

2.3.1大鼠動(dòng)靜脈環(huán)路血栓模型的制備及給藥取SD大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只。分生理鹽水對(duì)照組、鈉陽(yáng)性對(duì)照組、濕法超微粉碎-超濾法組（分低、高劑量）、酶解組。按2.2.1項(xiàng)下方法給藥，大鼠灌胃7天，每天1次。將大鼠腹腔注射10%(按0.35 g·kg-1)麻醉，參照文獻(xiàn)[5]制作動(dòng)靜脈環(huán)路血栓模型。大鼠于仰臥位固定后分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和左側(cè)頸外靜脈，并將2根管內(nèi)注滿肝素生理鹽水(25U.mL-1)的聚乙烯管分別插入右頸總動(dòng)脈及左頸外靜脈，在動(dòng)-靜脈旁路的連接管中放入1根長(zhǎng)為8cm的7號(hào)手術(shù)線（已稱重），建立動(dòng)靜脈旁路，用藥40 min后開(kāi)放動(dòng)靜脈環(huán)路15min，中形成血栓。

2.3.2動(dòng)靜脈環(huán)路血栓測(cè)定 15 min后取下套管，取出血栓，在濕潤(rùn)的濾紙上滾動(dòng)，去除多余浮血，置已稱重的載玻片上稱重，并減去載玻片和手術(shù)線的質(zhì)量，即得血栓濕重，計(jì)算得血栓抑制率。于70℃干燥箱中1h，待其冷卻后稱取干重，求出血栓抑制率[6]。數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，結(jié)果見(jiàn)表1。

血栓抑制率=(對(duì)照血栓濕重-試驗(yàn)血栓濕重）/對(duì)照血栓濕重×99%

結(jié)果顯示，濕法低劑量組、高劑量組及酶解組均能顯著抑制動(dòng)靜脈環(huán)路血栓的形成，使血栓形成的濕、干重明顯減輕，與生理鹽水組相比差別有顯著性，其中濕法組抗血栓作用呈現(xiàn)濃度依賴性。

過(guò)程的主要優(yōu)勢(shì)有提取時(shí)間縮短為10min，提取效率高，采用常溫提取法，避免了加熱對(duì)全蝎蛋白的破壞，有效、全面地保留了全蝎蛋白質(zhì)類成分。

3討論

全蝎的主要有效成分為蛋白質(zhì)[7]，全蝎中發(fā)揮抗凝血作用的成分為全蝎蛋白[7。本研究組發(fā)現(xiàn)，全蝎蛋白成分本身的體外抗凝血、抗血栓作用并不明顯，但其酶解后產(chǎn)物則具有明顯的體外抗凝血和抗血栓作用。本研究通過(guò)大鼠體內(nèi)試驗(yàn)，證明全蝎提取蛋白經(jīng)大鼠口服給藥后，均能發(fā)揮明顯的體內(nèi)抗凝血、抗血栓作用。

本試驗(yàn)另辟蹊徑地探索全蝎蛋白提取的新方法-濕法超微粉碎提取技術(shù)，將全蝎和與水一起加入粉碎機(jī)，應(yīng)用強(qiáng)大機(jī)械振動(dòng)研磨，使全蝎達(dá)到細(xì)胞級(jí)粉碎，全蝎蛋白快速溶解于水中。所得全蝎蛋白大鼠體內(nèi)藥效抗凝血、抗血栓作用明顯，證明該提取過(guò)程的主要優(yōu)勢(shì)有提取時(shí)間縮短為10min，提取效率高，采用常溫提取法，避免了加熱對(duì)全蝎蛋白的破壞，有效、全面地保留了全蝎蛋白類成分。

全蝎蛋白的濃縮大部分采用了加熱濃縮法，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而失去其活性。本試驗(yàn)采用PES中空纖維膜，對(duì)全蝎蛋白進(jìn)行濃縮，操作時(shí)間短，并且避免了加熱對(duì)蛋白質(zhì)的破壞，保留了大部分分子量的全蝎蛋白，通過(guò)大鼠體內(nèi)藥效試驗(yàn)證明了其抗凝血和抗血栓作用，為膜濃縮全蝎蛋白方法的應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。本試驗(yàn)對(duì)膜濃縮過(guò)程的參數(shù)進(jìn)行了考察，篩選出組合參數(shù)。

凝血時(shí)間是觀察各提取方法所得全蝎蛋白對(duì)凝血機(jī)制有無(wú)影響進(jìn)行的步試驗(yàn)，是研究藥物抗凝血機(jī)制的前提。結(jié)果表明濕法組提取所得全蝎蛋白同酶解組一樣，均對(duì)大鼠全血CT有明顯延長(zhǎng)作用。濕法組提取所得全蝎蛋白能顯著延長(zhǎng)大鼠血漿的TT，PT，APTT，表明該提取方法所得蛋白對(duì)大鼠血漿凝血系統(tǒng)有明顯影響，對(duì)內(nèi)源性、外源性以及共同途徑凝血均有明顯的抑制作用。濕法組提取所得蛋白能明顯抑制大鼠體內(nèi)血栓的形成，表現(xiàn)出了其體內(nèi)抗血栓作用。通過(guò)以上分析，濕法超微粉碎-超濾法快速提取濃縮所得全蝎蛋白口服后對(duì)大鼠有明顯的抗凝血和抗血栓作用，從藥效學(xué)上證明了該方法可應(yīng)用于全蝎蛋白的提取濃縮過(guò)程。本研究為濕法超微粉碎-超濾法應(yīng)用于全蝎蛋白的快速提取濃縮過(guò)程提供了藥效學(xué)依據(jù)，大大地簡(jiǎn)化了全蝎蛋白提取濃縮過(guò)程，為全蝎粗蛋白的提取和富集提供了新方法。

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