摘要:目的 觀察Y迷宮訓練對成年大鼠海馬齒狀回(dentate gyrus ,DG) 神經干細胞/ 前體細胞的增殖作用。
方法 通過Y迷宮訓練,用52溴222脫氧核苷(52bromo222deoxyuridine ,BrdU) 標記增殖細胞,用ABC **細
胞化學方法觀察成年大鼠海馬齒狀回細胞的增殖情況。結果 Y迷宮訓練組海馬齒狀回BrdU 陽性細胞數明顯多
于對照組( P < 0. 05) ,且Y迷宮訓練成績的優(yōu)劣與海馬齒狀回神經細胞增殖的多少存在相關性,學習成績良好組
齒狀回BrdU 陽性細胞數顯著多于學習成績低劣組( P < 0. 05) 。結論 Y迷宮訓練可促進成年大鼠海馬齒狀回神
經干細胞/ 前體細胞的增殖。
關鍵詞: Y迷宮; 學習; 海馬; 細胞增殖
近年的研究[1 ,2 ]表明:成年哺乳動物海馬終生
存在神經發(fā)生(neurogenesis) ,其**區(qū)位于海馬齒
狀回的顆粒下層( subgranular layer , SGL) 。成年海
馬神經的發(fā)生受多種因素的調節(jié),包括生理因素和
病理因素。促進神經發(fā)生的因素有豐富多彩的環(huán)
境、運動、癲癇等;抑制神經發(fā)生的有應激、衰老及5
- 羥色胺缺失等[3 ,4 ] 。學習記憶也能促進海馬神經
發(fā)生。Gould 等[5 ]報道經典的條件反射及Morris 水
迷宮學習能促進海馬齒狀回新生神經元的存活。
Lemaire 等[6 ] 的研究表明,Morris 水迷宮學習能促進海馬齒狀回神經干細胞/ 前體細胞的增殖。目前
國內外有關學習記憶對海馬神經發(fā)生的研究大多使
用Morris 水迷宮模型[1 ,5 ,6 ] ,用Y 迷宮模型的還未
見報道。因此,本研究探討Y迷宮訓練對海馬神經
發(fā)生的作用?，F(xiàn)報道如下。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實驗動物和分組 成年雄性SD 大鼠18
只,體重180～220 g ,蘇州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。將動物隨機分成對照組(動物置于Y迷宮內
自由活動,不施以電擊和燈光指示,放置的時間和輪
次同訓練組, n = 6) 和Y 迷宮訓練組(每日訓練3
輪,時間點為9∶00 、12∶00 、15∶00 ,每輪訓練20 次,
連續(xù)3 d , n = 12) 。
1. 1. 2 實驗試劑 BrdU ,美國Roche 公司;BrdU
單克隆抗體, 美國Biosource 公司; 羊抗鼠二抗及
ABC(avidin2biotin complex ,ABC) 試劑盒,Vector 公
司;DAB 顯色劑,美國Sigma 公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 BrdU 標記 于**輪和第三輪Y 迷宮訓
練前1 h ,取BrdU 50mg/ kg , 溶于生理鹽水,腹腔注
射2 次/ d ,間隔6 h ,連續(xù)3 d。第4 d 處死動物。
1. 2. 2 學習記憶訓練 Y 迷宮由3 個相同的臂組
成,分別稱為Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)、Ⅲ區(qū)。通常把下臂( Ⅰ臂)定為起步區(qū),左側( Ⅱ臂) 為安全區(qū),右側( Ⅲ臂) 為電
擊區(qū),三臂相交處為隔離區(qū)(0 區(qū)) 。迷宮底鋪以銅
棒,可以通電刺激。三臂頂端各裝有15W 的信號
燈。實驗前先將大鼠放入迷宮,讓其適應5 min ,訓
練組大鼠在起步區(qū)予以電擊致其逃至安全區(qū),燈光
持續(xù)15 s ,然后熄燈休息45 s ,開始下一次操作。每
次實驗在每只大鼠上重復20 次為一輪。實驗在黑
暗、安靜的環(huán)境中進行。凡大鼠受電擊后10 s 內一
次性從起步區(qū)逃至安全區(qū)的反應稱為“正確反應”,
否則為“錯誤反應”。以連續(xù)10 次電擊中正確反應
達9 次或以上定為學會標準。達到學會標準所需的
電擊次數表示學習記憶成績,電擊次數少說明學習
能力強。
1. 2. 3 **組織化學檢測 大鼠經4 %的水合氯
醛麻醉,開胸,左心室插管至主動脈,先快速灌流
0. 01mol/ L 的磷酸鹽緩沖液( phosphate buffered
saline , PBS) , 再用4 %的多聚甲醛(paraformalde2
hyde , PFA) 緩慢灌流。取腦置于4 %的PFA 中固
定8 h 后,再轉入20 %的蔗糖中過夜,從前囟后3. 3
～5. 1 mm 作連續(xù)冰凍切片,片厚30 μm ,隔2 張取
1 張。**組織化學ABC 法的步驟詳見本實驗室
以往的研究[7 ] ,簡要步驟如下:腦片于4 mol/ L 的鹽酸中室溫下孵育30 min ;0. 1 %的37 ℃孵育10
min ;小鼠單克隆抗體BrdU 一抗室溫下過夜( 1 ∶
200 ,Biosource) ;羊抗鼠二抗室溫下孵育2 h (A/ B∶
200 ,Vector) ;DAB 顯色5 min。各步驟間用0. 01
mol/ L 的PBS 漂洗3 次,每次5 min。常規(guī)封片,在
光鏡下觀察**反應陽性細胞,并計數和作顯微攝
影。
1. 2. 4 統(tǒng)計方法 每只大鼠隨機選取4～5 張腦
片,光學顯微鏡下( ×400 倍) 計數每張腦片雙側海
馬齒狀回顆粒細胞層(granular cell layer , GCL) 、顆
粒下層及門區(qū)的BrdU 陽性細胞數。取每只大鼠4
～5 張腦片BrdU 陽性細胞的均數作為統(tǒng)計數據,以
均數±標準差( .x ±s) 表示,并用SPSS10. 0 軟件作
方差分析,Excel 作數據處理并制成統(tǒng)計圖。
2 結果
2. 1 學習記憶訓練結果 12 只成年大鼠經過3 d
的Y迷宮學習訓練后,所有大鼠均達到學會標準。
2. 2 **組化檢測結果 對照組成年大鼠海馬齒
狀回可見少量的BrdU 陽性細胞,分布在齒狀回顆
粒細胞層、顆粒下層及門區(qū),且大多位于海馬齒狀回
顆粒下層。BrdU 陽性細胞常聚集成叢,細胞核較
小,形態(tài)不一,呈圓形、橢圓形或無規(guī)則型(圖1a) ;
海馬齒狀回BrdU 陽性細胞數為39. 37 ±2. 32 。訓
練組大鼠海馬齒狀回的BrdU 陽性細胞亦分布在顆
粒細胞層、顆粒下層及門區(qū),其中以顆粒下層增多*
明顯(圖1b、圖1c) ;BrdU 陽性細胞數為57. 43 ±
11. 29 。兩組的BrdU 陽性細胞數比較,有顯著性差
異( P < 0. 05) 。
2. 3 Y迷宮訓練成績優(yōu)劣與海馬齒狀回細胞增殖
的關系 12 只成年大鼠進行Y迷宮訓練后,達到學
會標準時電擊次數的均數為40. 75 。學習記憶能力
優(yōu)劣的判定,以每只大鼠達到學會標準時的電擊次
數為依據。低于40. 75 ,列為學習成績良好組( n =
6) ;高于40. 75 ,列為學習成績低劣組( n = 6) 。**
組織化學結果顯示,學習成績良好組齒狀回BrdU
陽性細胞數(65. 48 ±10. 51) 多于成績低劣組(49. 38
±3. 49) ( P < 0. 05 ,如圖2) 。再將每只大鼠Y迷宮
訓練達到學會標準時的電擊次數和齒狀回BrdU 陽
性細胞數之間作相關分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間呈明顯負
相關( r = - 0. 91 ,圖3) 。說明齒狀回BrdU 陽性細
胞數的增加與Y迷宮訓練的成績密切相關,訓練成
績越好,海馬齒狀回細胞增殖越多。
3 討論
海馬與學習記憶密切相關。Y迷宮用于檢測大
鼠空間辨別的學習記憶能力,大鼠在迷宮中對電刺
激出現(xiàn)被動逃避反應,經過多次訓練后大鼠能學會
并記住迷宮安全區(qū)的空間位置?？臻g定位的記憶障
礙只有在海馬或海馬周圍區(qū)域受到損傷的情況下才
會出現(xiàn)。摘除雙側海馬出現(xiàn)空間學習、記憶障礙,可1. 2. 4 統(tǒng)計方法 每只大鼠隨機選取4～5 張腦
片,光學顯微鏡下( ×400 倍) 計數每張腦片雙側海
馬齒狀回顆粒細胞層(granular cell layer , GCL) 、顆
粒下層及門區(qū)的BrdU 陽性細胞數。取每只大鼠4
～5 張腦片BrdU 陽性細胞的均數作為統(tǒng)計數據,以
均數±標準差( .x ±s) 表示,并用SPSS10. 0 軟件作
方差分析,Excel 作數據處理并制成統(tǒng)計圖。
2 結果
2. 1 學習記憶訓練結果 12 只成年大鼠經過3 d
的Y迷宮學習訓練后,所有大鼠均達到學會標準。
2. 2 **組化檢測結果 對照組成年大鼠海馬齒
狀回可見少量的BrdU 陽性細胞,分布在齒狀回顆
粒細胞層、顆粒下層及門區(qū),且大多位于海馬齒狀回
顆粒下層。BrdU 陽性細胞常聚集成叢,細胞核較
小,形態(tài)不一,呈圓形、橢圓形或無規(guī)則型(圖1a) ;
海馬齒狀回BrdU 陽性細胞數為39. 37 ±2. 32 。訓
練組大鼠海馬齒狀回的BrdU 陽性細胞亦分布在顆
粒細胞層、顆粒下層及門區(qū),其中以顆粒下層增多*
明顯(圖1b、圖1c) ;BrdU 陽性細胞數為57. 43 ±
11. 29 。兩組的BrdU 陽性細胞數比較,有顯著性差
異( P < 0. 05) 。
2. 3 Y迷宮訓練成績優(yōu)劣與海馬齒狀回細胞增殖
的關系 12 只成年大鼠進行Y迷宮訓練后,達到學
會標準時電擊次數的均數為40. 75 。學習記憶能力
優(yōu)劣的判定,以每只大鼠達到學會標準時的電擊次
數為依據。低于40. 75 ,列為學習成績良好組( n =
6) ;高于40. 75 ,列為學習成績低劣組( n = 6) 。**
組織化學結果顯示,學習成績良好組齒狀回BrdU
陽性細胞數(65. 48 ±10. 51) 多于成績低劣組(49. 38
±3. 49) ( P < 0. 05 ,如圖2) 。再將每只大鼠Y迷宮
訓練達到學會標準時的電擊次數和齒狀回BrdU 陽
性細胞數之間作相關分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間呈明顯負
相關( r = - 0. 91 ,圖3) 。說明齒狀回BrdU 陽性細
胞數的增加與Y迷宮訓練的成績密切相關,訓練成
績越好,海馬齒狀回細胞增殖越多。
3 討論
海馬與學習記憶密切相關。Y迷宮用于檢測大
鼠空間辨別的學習記憶能力,大鼠在迷宮中對電刺
激出現(xiàn)被動逃避反應,經過多次訓練后大鼠能學會
并記住迷宮安全區(qū)的空間位置?？臻g定位的記憶障
礙只有在海馬或海馬周圍區(qū)域受到損傷的情況下才
會出現(xiàn)。摘除雙側海馬出現(xiàn)空間學習、記憶障礙,可見Y迷宮學習訓練需要海馬的參與,是依賴海馬的
學習訓練[8 ] 。
實驗中,我們用52溴222脫氧核苷(BrdU)
標記增殖細胞。BrdU 是胸腺嘧啶核苷的類似物,當
細胞處于DNA 合成期(即S 期) ,摻入到新合成的
DNA 中,能較好地反映齒狀回細胞的增殖情況。
本實驗結果發(fā)現(xiàn),未經Y迷宮訓練的大鼠海馬
齒狀回內可見少量的BrdU 陽性細胞,且大多沿顆
粒下層聚集狀分布,提示增殖細胞是由一個神經干
細胞/ 前體細胞分裂而來的。學習訓練可以影響海
馬的神經發(fā)生,Morris 水迷宮學習可促進海馬齒狀
回神經前體細胞增殖及存活[5 ,6 ] 。本實驗結果顯
示,Y迷宮訓練組齒狀回BrdU 陽性細胞數多于對
照組,其中以顆粒下層增多*明顯?？梢?/span>Y迷宮訓
練能增加齒狀回BrdU 陽性細胞數,促進海馬神經
干細胞/ 前體細胞的增殖。
海馬新生神經元參與了依賴海馬的學習記憶形
成。跑步、豐富多彩的環(huán)境[3 ,4 ]能促進海馬神經發(fā)生,提高水迷宮實驗的成績;長期應激[3 ,4 ]在抑制海
馬神經發(fā)生的同時,降低水迷宮實驗成績。這些都
支持海馬神經發(fā)生與空間學習能力相關的論點。本
實驗結果表明:學習成績的優(yōu)劣與海馬齒狀回神經
發(fā)生存在相關性,學習成績良好組齒狀回BrdU 陽
性細胞多于成績低劣組。Ambrogini 等[9 ]也報道過
類似的結果,他們發(fā)現(xiàn)Morris 水迷宮學習成績與海
馬齒狀回神經發(fā)生直接相關,成績良好的大鼠齒狀
回BrdU 陽性細胞多于成績低劣的大鼠。
至于這些新生細胞的分化前景,有待今后進一
步探討。
