荷瘤小鼠抑郁狀態(tài)的研究

懸尾實驗tail-suspension test TST

摘要：目的 觀察荷瘤小鼠大腦皮層和海馬腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)表達水平變化，初步探討荷瘤應激引起抑郁的分子機制。方法 建立荷瘤小鼠模型；以不同荷瘤時間的懸尾實驗 （tail-suspension test，TST）的反應作為抑郁行為學指標；采用半定量及實時定量PCR技術分別測定荷瘤12d后小鼠大腦皮層及海馬BDNF水平。結果 荷瘤組小鼠在TST中的不動時間隨腫瘤接種時間延長而逐漸增加，于荷瘤第12天顯著降低。同時，荷瘤第12天的小鼠大腦皮層及海馬BDNF水平也明顯降低，處理可增加海馬BDNF的表達。結論 荷瘤應激可通過降低海馬及大腦皮質BDNF水平誘發(fā)抑郁絕望狀態(tài)。懸尾實驗tail-suspension test TST荷瘤小鼠抑郁狀態(tài)的研究（懸尾）

關鍵詞：荷瘤；抑郁；腦源性神經營養(yǎng)因子；懸尾實驗tail-suspension test TST

懸尾實驗tail-suspension test TST懸尾實驗tail-suspension test TST

懸尾實驗tail-suspension test TST荷瘤小鼠抑郁狀態(tài)的研究（懸尾）

荷瘤小鼠抑郁狀態(tài)的研究（懸尾）

The study on the development of depression in H22 tumor-bearingmice懸尾實驗tail-suspension test TST

Abstract: Objective To explore the molecular mechanisms of depression development inH22 tumor-bearing mice. Methods Tail-suspension test (TST) wasobserved as the despair behavioral response in H22 tumor-bearingmice. The expression of BDNF in the cerebrum and hippocampus ofmice were determined by RT-PCR and real time quantitative RT-PCRrespectively. Results The immobility time in TST was increased asthe tumor developed, and it changed significantly at 12 days aftertumor implantation. In the mean time, the expression of BDNFdecreased significantly in H22 tumor-bearing mice. The decreasedexpression of BDNF in hippocampus could be antagonized byfluoxetine for 12 days of treatment. Conclusion Tumor burden might induce stress-relateddepressive state by down-regulating the expression ofBDNF.

Key words tumor-bearing；depression；BDNF;Fluoxetine懸尾實驗tail-suspension test TST懸尾實驗tail-suspension test TST

臨床大量研究表明腫瘤患者的抑郁癥發(fā)病率及嚴重程度遠遠高出一般人群，但缺乏關于腫瘤與抑郁之間關系的基礎研究。關于抑郁的發(fā)病機制說法不一，目前較看法認為與應激及應激性**關系密切。Sterling和Eyer于1988年提出了"非穩(wěn)態(tài)（allostasis）概念，McEwen等又于1993年詳細描述了非穩(wěn)態(tài)負荷(allostasis load), 即指機體偏離機體自身穩(wěn)態(tài)的程度。非穩(wěn)態(tài)負荷可使機體通過調整達到穩(wěn)態(tài)。正是由于非穩(wěn)態(tài)，自主神經系統(tǒng)、下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸和機體各系統(tǒng)不僅能對內源性和外源性應激源產生積極反應以保護機體,也會因慢性過度的或消極的反應而導致機體的紊亂和衰竭。研究還發(fā)現(xiàn)應激可以通過下調抑郁癥患者大腦海馬及大腦皮質神經營養(yǎng)因子如腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived nuerotrophic factor, BDNF）水平致神經元損傷和、影響神經元再塑和神經發(fā)生、使海馬體積改變^[1]。CT、MRI檢查結果也證實抑郁癥患者均有不同程度的大腦皮質和海馬容積減少。同時大量證據(jù)發(fā)現(xiàn)癌癥患者及荷瘤動物血漿中應激**包括GCS, ACTH等均有不同程度的改變。因此，我們提出假設：腫瘤作為一機體的惡性刺激，是否可影響機體的應激反應，*終誘發(fā)抑郁狀態(tài)。我們擬通過懸尾實驗（tail-suspension test, TST）測定荷瘤小鼠不動時間來觀察其抑郁狀態(tài)，并通過PCR技術來測定其海馬及大腦皮質中BDNF表達，從而從分子水平研究其抑郁狀態(tài)發(fā)生的機制，初步闡明腫瘤與產生抑郁的關系。懸尾實驗tail-suspension test TST

懸尾實驗tail-suspension test TST

1 材料與方法懸尾實驗tail-suspension test TST

懸尾實驗tail-suspension test TST

1.1 試劑及動物：鹽酸（Fluoxetine）膠囊，由Eli lilly and companylimited生產，規(guī)格：20mg/每粒，批號：。健康balb/c雄性小鼠，體重18+2g；雄性肝癌H22腹水瘤小鼠，均為上海斯萊克實驗動物有限公司提供。懸尾實驗tail-suspension test TST

1.2 動物分組及荷瘤模型的建立 隨機將健康小鼠分為3組，正常對照組，荷瘤組及荷瘤處理組。取腹水瘤的種鼠，處死后抽取腹水液，生理鹽水稀釋4倍配制成瘤細胞懸液，約1×10⁷個/ml,0.2ml皮下接種于小鼠右腋下。荷瘤加組小鼠每日用20mg/kg灌胃一次。

1.3 懸尾實驗 將小鼠倒置懸吊，在5分鐘內計算小鼠靜止的時間.

1.4 RT-PCR法測定大腦皮層組織BDNF的表達 小鼠處死后，取出海馬組織，抽提RNA，逆轉為cDNA。BDNF及beta-actin的引物序列分別為5’-TCATTGGTAACCTCGCTCAT-3’; 5’-CCGAACCTTCTGGTCCTC-3 和5’-ACAGGCATTGTGATGGACTC-3’;5’-TTGATGTCACGCACGATTT-3。

1.5 實時定量RT-PCR測定海馬BDNF的表達 2-SYBR為PCR的綠色熒光標記，引物序列為5’-GAGTCTTTGGTGGTTTGTGA-3’及5’-GCTCGGGTAGTTCGCTTTA-3’。95°C持續(xù)15分鐘，然后經歷40個循環(huán)使cDNA擴增，每個循環(huán)包括15秒94°C高溫變性、30秒56°C低溫退火、30秒72°C延伸。懸尾實驗tail-suspension test TST

1.6 統(tǒng)計學分析 計量資料均以均數(shù)±標準差表示（Mean±s），采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為顯著性差異。懸尾實驗tail-suspension test TST

懸尾實驗tail-suspension test TST

2 結果懸尾實驗tail-suspension test TST

懸尾實驗tail-suspension test TST

2.1 荷瘤對小鼠TST的不動時間的影響 TST是經典的抑郁行為學實驗，小鼠為克服不正常體位而掙扎活動, 但活動一定時間后, 出現(xiàn)間隙性不動, 顯示“失望”狀態(tài), 因此，小鼠的不動時間反映了其抑郁狀態(tài)。在本實驗中，分別在第0天、第6天、第8天以及第12天測定小鼠的不動時間，發(fā)現(xiàn)隨著荷瘤時間的增長，小鼠的不動時間逐漸延長。而連續(xù)處理12天可顯著縮短荷瘤小鼠的不動時間（圖1）。懸尾實驗tail-suspension test TST

圖1 荷瘤對小鼠TST不動時間的影響懸尾實驗tail-suspension test TST

Fig 1. Effects ofH22 tumor implantation on the immobility time (s) in the TST ofmice (Mean±s, n=10) 懸尾實驗tail-suspension test TST

**P<0.01 vs before tumor implantation；^c P<0.01 vs 12days after tumor implantation

2.2 荷瘤對小鼠海馬BDNF表達的影響 實時定量PCR結果表明海馬組織中的BDNF表達下降，處理12天后BDNF表達上調，與荷瘤模型組存在顯著差異（表1，圖2）。懸尾實驗tail-suspension test TST

表1.荷瘤對小鼠海馬BDNF表達的影響

Tab 1. BDNF level in the hippocampus of H22 tumor-bearing mice (Mean±s, n=5)

**P<0.01 vs before tumor implantation；^b P<0.05 vs 12days after tumor implantation

懸尾實驗tail-suspension test TST

圖2 實時PCR技術測定小鼠海馬BDNF水平

Fig 2. BDNF level in hippocampus byreal-time PCR (Mean±s, n=5)

**P<0.01 vs before tumor implantation；^b P<0.05 vs 12days after tumor implantation

懸尾實驗tail-suspension test TST

2.3 荷瘤對小鼠皮層<%3